Translate

Minggu, 29 Desember 2013

Penghitungan Kualitas Mikroba: Hitungan Cawan (TPC) Dan Biomassa Sel (Metode Turbidimetrik)


 
A.       Tujuan
1.      Mengetahui dan menguasai teknik pengenceran dan penentuan konsentrasi biomassa bakteri yang viable dengan metode hitungan cawan (TPC)
2.      Mengetahui penentuan turbiditas suatu kultur mikroba dengan menggunakan spektrofotometer dan korelasinya terhadap hitungan sel yang bersangkutan

B.     Bahan dan Alat

Ø  Bahan
    • Kultur Saccharomyces cereviceae dalam NB
    • Media NB steril
    • Media NA cair
    • Medium NB steril dalam tabung reaksi
    • Akuades
    • Api bunsen/ spiritus
    • Alkohol
    • Kapas
    • Aluminium foil

Ø  Alat
    • Tabung fotokolorimeter
    • Pipet steril
    • Cawan petri steril
    • Tabung reaksi
    • Waterbath
    • Spectrofotometer spectronic 20
C.    Dasar Teori
Dalam istilah pertumbuhan umumnya digunakan bakteri dan mikroorganisme yang lainnya dan biasanya lebih mengacu pada perubahan di dalam hasil panen sel dan bukanlah dilihat. Dari pertambahan jumlah individu mikroorganisme tersebut. Suatu proses pertumbuhan menyatakan pertambahan jumlah atau massa yang melebihi dari yang ada di dalam inokulum asalnya (Volk, 1993).
Fardiaz (1993) menyatakan ada beberapa cara yang dapat digunakan untuk menghitung atau mengukur jumlah jasad renik di dalam suatu suspensi atau bahan. Cara tersebut dibedakan atas beberapa kelompok yaitu: perhitungan jumlah sel, terdiri dari hitungan mikroskopik,  hitungan cawan, MPN (Most Probable Number); perhitungan massa sel secara langsung, terdiri dari volumetrik, gravimetrik, kekeruhan (turbidimetri); perhitungan massa sel secara tidak langsung, terdiri dari analisis komponen sel, analisis produk katabolisme, dan analisis konsumsi nutrient. Cara penghitungan pada lempeng pembiakan disebut juga metode penghitungan bakteri hidup atau metode penghitungan koloni. Pada penghitungan koloni, dilakukan penyimpanan pada suhu yang sesuai. Oleh karena itu, suatu bakteri dapat tumbuh menjadi satu koloni yang terhitung mewakili jumlah bakteri hidup yang terdapat dalam tiap volume pengenceran yang digunakan.
Prinsip dari metode hitungan cawan adalah menumbuhkan sel mikroba yang masih hidup pada metode agar, sehingga sel mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode hitungan cawan dapat dibedakan atas dua cara yaitu:  metode tuang (pour plate) dan metode permukaan/sebar (surface/spread plate) (Fardiaz, 1993). Untuk memenuhi persyaratan statistik, cawan yang dipilih untuk dihitung mengandung 30-300 koloni. Untuk memenuhi persyaratan tersebut dilakukan sederatan pengenceran dan pencawan. Jumlah mikroba dalam sampel ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan. Satuan yang  digunakan untuk menyatakan jumlah koloni atau bakteri adalah cfu/mL (cfu = colony forming units) (Waluyo 2008).

D.    Prosedur Kerja
1.      Menyiapkan enam tabung reaksi masing-masing berisi 9 ml medium NB steril dan memberi label untuk masing-masing pengenceran
2.       Mengocok atau memvortek suspensi biakan yeast sampai kekeruhannya merata (homogen). Pengocokan sebaiknya dilakukan lebih dari 25 kali atau memvorteknya selama satu menit supaya homogen. Kemudian secara aseptik dipipet 5 ml suspensi yeast dan memasukkannya ke dalam tabung fotokolorimeter untuk diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer yang telah diset  setiap akan mengukur nilai absorbansi, tabung fotokolorimeter diseka dengan tissue. Bila nilai absorbansinya lebih dari 1, maka sampel diencerkan dengan blanko (medium NB steril) sampai perbandingan tertentu untuk mendapatkan nilai absorbansinya <1. kemudian mencatat nilai absorbansinya yang diperoleh sebagai nilai absorbansinya pengenceran 1 : 10° atau nilai absorbansi suspensi biakan yeast awal. Hasil OD sebenarnya adalah faktor pengenceran dikali nilai OD setelah diencerkan. Setelah itu pipet 1 ml lagi suspensi biakan yeast secara aseptik untuk dimasukkan ke dalam cawan petri steril yang berlabel 1 : 10°. Selanjutnya pipet lagi 1 ml suspensi biakan yeast dan memasukkannya ke dalam tabung reaksi berlabel 1 : 101 untuk mendapatkan suspensi biakan yeast dengan nilai pengenceran 1 : 101. Setelah itu meletakkan pipet dalam tempat desinfektan.
3.  Langkah nomor 3 sama dengan langkah nomor 2, yaitu melakukan serangkaian seri pengenceran mulai 1 : 101, 1 : 102, ..., 1 : 106 disertai pengukuran nilai adsorbansi dan pemindahan 1 ml suspensi biakan masing-masing seri pengenceran ke dalam cawan petri steril yang sesuai (berlabel sama) dengan seri pengenceran tersebut.
4.   Menyiapkan medium NA cair (±50° C) dan menuangkan ke dalam ke tujuh cawan petri yang telah berisi suspensi biakan yeast dari serangkaian seri pengenceran (1 : 100, 1 : 101, 1 : 102, ..., 1 : 106). Kemudian memutar masing-masing cawan petri diatas meja dengan perlahan-lahan sebanyak 20x dengan gerakan membentuk angka 8.
5.      Membiarkan agar dalam cawan petri menjadi padat. Setelah itu meletakkan cawan petri dalam posisi terbalik dan menginkubasinya pada suhu kamar (±37° C) selama 24 jam.
6.      Mengamati pertumbuhan dengan menghitung populasi koloni yang muncul dengan bantuan coulter counter. Memilih cawan yang jumlah koloninya antara 30-300. Bila jumlah koloni dalam satu cawan kurang atau lebih dari 30-300, maka tidak memenuhi syarat untuk dihitung. Kalkulasi jumlah organisme atau yeast dalam sampel adalah jumlah koloni yang memenuhi syarat, lalu menghitung rata-ratanya dan jumlah koloni yang terhitung perpengencerannya hanya menggunakan dua bilangan nyata. Satuan yang menggunakan adalah jumlah organisme per ml biakan atau sampel (cfu/ml).
7.      Hasil akhir dari praktikum diperoleh suatu grafik antara nilai absorbansi (OD) masing-masing nilai pengenceran (sumbu y) dengan jumlah koloni masing-masing pengenceran (sumbu x), sehingga diketahui korelasi antara nilai OD (kekeruhan) dengan jumlah sel viable dalam biakan

E.     Hasil pengamatan
Grup
OD A610nm
Jumlah sel/ml
cfu/ml
Tingkat Pengenceran
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
10-9
1
0,015
2,88.104
288
92
23
15
-
-
-
-
2
0,02
8,4. 105
-
-
84
23
1
12
-
-
3
0,04
 1,10. 107
-
-
-
110
17
3
4
-
4
0,051
-
-
-
-
-
8
632
628
13

Dari tabel pengamatan di atas didapat beberapa nilai yang memenuhi persyaratan statistik pada masing- masing OD, data yang memenuhi sebagai berikut :

OD
CFU/ml
O,015
2,88 x 104
0.02
8,4 x 105
0,04
1,10 x 107




 

            Korelasi yang didapatkan yaitu 0,6603.
F.     Pembahasan
Pada praktikum kali ini kami mempelajari tentang penghitungan kuantitas mikroba. Mikroba yang digunakan dalam praktikum adalah Saccharomyces cereviceae. Metode yang digunakan untuk penghitungan mikroba ini adalah metode hitungan cawan (TPC). Dalam metode ini ada beberapa hal yang harus diperhatikan yaitu mengencerkan sampel dan mencawankan hasil pengenceran tersebut.
Sebelumnya telah disediakan biakan dengan volume 9 ml. Dari biakan tersebut  dihitung terlebih dahulu berapa kandungan OD nya. Setelah diketahui kandungan OD dilakukan pengenceran pada biakan tersebut.  Pengenceran dilakukan beberapa kali, yaitu 10-2, 10-3, 10-4, dan 10-5. Hasil pengenceran tersebut dibiakkan dalam cawan. Kemudian didiamkan selama tiga hari untuk dapat dilakukan penghitungan. Penghitungan mikroba dengan metode cawan menggunakan alat spektrofotometer.
Dari hasil pengamatan dapat diketahui bahwa semakin tinggi kandungan OD semakin banyak kandungan selnya begitu pula sebaliknya. Semakin tinggi pengenceran semakin jarang bakterinya.
Nilai koefisien determinan (R2) dari korelasi rata-rata jumlah koloni adalah sebesar 0,6603. Nilai koefisien determinan yang tepat adalah 1. Dari nilai yang kami dapatkan masih terlalu jauh dari 1. Hal ini dapat disebabkan karena kurang telitinya dalam praktikum.

G.    Kesimpulan
1.      Jumlah mikroba yang memenuhi syarat yaitu:
Pada OD 0,015 jumlahnya 2,88 x 104
Pada OD 0,02 jumlahnya 8,4 x 105
Pada OD 0,04 jumlahnya 1,10 x 107
2.      Semakin besar jumlah pengenceran maka jumlah sel mikroba semakin sedikit, sedangkan semakin besar OD jumlah sel bakteri semakin banyak.
3.      Nilai koefisien determinan (R2) dari korelasi rata-rata jumlah koloni dengan kekeruhan adalah sebesar 0,6603.

H.    Daftar Pustaka
Hadioetomo, Ratna Siri. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek  Jakarta: PT
Gramedia Pustaka Utama
Pelezar, Michael J. Dan E.C.S Chan. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta:
Penerbit Universitas Indonesia
Suriawiria, Drs.Unus.1998. Pengantar Mikrobiologi Umum. Bandung :   Angkasa

Tidak ada komentar:

Posting Komentar