A.
Tujuan
1. Mengetahui dan menguasai teknik pengenceran dan penentuan
konsentrasi biomassa bakteri yang viable dengan metode hitungan cawan (TPC)
2. Mengetahui penentuan turbiditas suatu kultur mikroba
dengan menggunakan spektrofotometer dan korelasinya terhadap hitungan sel yang
bersangkutan
B.
Bahan dan Alat
Ø
Bahan
- Kultur Saccharomyces cereviceae dalam NB
- Media NB steril
- Media NA cair
- Medium NB steril dalam tabung reaksi
- Akuades
- Api bunsen/ spiritus
- Alkohol
- Kapas
- Aluminium foil
Ø
Alat
- Tabung fotokolorimeter
- Pipet steril
- Cawan petri steril
- Tabung reaksi
- Waterbath
- Spectrofotometer spectronic 20
C.
Dasar
Teori
Dalam istilah pertumbuhan umumnya digunakan
bakteri dan mikroorganisme yang lainnya dan biasanya lebih mengacu pada
perubahan di dalam hasil panen sel dan bukanlah dilihat. Dari pertambahan
jumlah individu mikroorganisme tersebut. Suatu proses pertumbuhan menyatakan
pertambahan jumlah atau massa yang melebihi dari yang ada di dalam inokulum
asalnya (Volk, 1993).
Fardiaz (1993) menyatakan ada beberapa cara
yang dapat digunakan untuk menghitung atau mengukur jumlah jasad renik di dalam
suatu suspensi atau bahan. Cara tersebut dibedakan atas beberapa kelompok yaitu:
perhitungan jumlah sel, terdiri dari hitungan mikroskopik, hitungan cawan, MPN (Most Probable Number);
perhitungan massa sel secara langsung, terdiri dari volumetrik, gravimetrik,
kekeruhan (turbidimetri); perhitungan massa sel secara tidak langsung, terdiri
dari analisis komponen sel, analisis produk katabolisme, dan analisis konsumsi
nutrient. Cara penghitungan pada lempeng pembiakan disebut juga metode
penghitungan bakteri hidup atau metode penghitungan koloni. Pada penghitungan
koloni, dilakukan penyimpanan pada suhu yang sesuai. Oleh karena itu, suatu
bakteri dapat tumbuh menjadi satu koloni yang terhitung mewakili jumlah bakteri
hidup yang terdapat dalam tiap volume pengenceran yang digunakan.
Prinsip dari metode hitungan cawan adalah
menumbuhkan sel mikroba yang masih hidup pada metode agar, sehingga sel mikroba
tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung
dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode hitungan cawan dapat dibedakan
atas dua cara yaitu: metode tuang (pour
plate) dan metode permukaan/sebar (surface/spread plate) (Fardiaz, 1993). Untuk
memenuhi persyaratan statistik, cawan yang dipilih untuk dihitung mengandung
30-300 koloni. Untuk memenuhi persyaratan tersebut dilakukan sederatan
pengenceran dan pencawan. Jumlah mikroba dalam sampel ditentukan dengan
mengalikan jumlah koloni dengan faktor pengenceran pada cawan yang
bersangkutan. Satuan yang digunakan
untuk menyatakan jumlah koloni atau bakteri adalah cfu/mL (cfu = colony forming
units) (Waluyo 2008).
D.
Prosedur
Kerja
1.
Menyiapkan
enam tabung reaksi masing-masing berisi 9 ml medium NB steril dan memberi label
untuk masing-masing pengenceran
2.
Mengocok atau memvortek suspensi biakan yeast
sampai kekeruhannya merata (homogen). Pengocokan sebaiknya dilakukan lebih dari
25 kali atau memvorteknya selama satu menit supaya homogen. Kemudian secara
aseptik dipipet 5 ml suspensi yeast dan memasukkannya ke dalam tabung
fotokolorimeter untuk diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer yang
telah diset setiap akan mengukur nilai
absorbansi, tabung fotokolorimeter diseka dengan tissue. Bila nilai
absorbansinya lebih dari 1, maka sampel diencerkan dengan blanko (medium NB
steril) sampai perbandingan tertentu untuk mendapatkan nilai absorbansinya
<1. kemudian mencatat nilai absorbansinya yang diperoleh sebagai nilai
absorbansinya pengenceran 1 : 10° atau nilai absorbansi suspensi biakan yeast
awal. Hasil OD sebenarnya adalah faktor pengenceran dikali nilai OD setelah
diencerkan. Setelah itu pipet 1 ml lagi suspensi biakan yeast secara aseptik
untuk dimasukkan ke dalam cawan petri steril yang berlabel 1 : 10°. Selanjutnya
pipet lagi 1 ml suspensi biakan yeast dan memasukkannya ke dalam tabung reaksi
berlabel 1 : 101 untuk mendapatkan suspensi biakan yeast dengan
nilai pengenceran 1 : 101. Setelah itu meletakkan pipet dalam tempat
desinfektan.
3. Langkah
nomor 3 sama dengan langkah nomor 2, yaitu melakukan serangkaian seri
pengenceran mulai 1 : 101, 1 : 102, ..., 1 : 106
disertai pengukuran nilai adsorbansi dan pemindahan 1 ml suspensi biakan
masing-masing seri pengenceran ke dalam cawan petri steril yang sesuai
(berlabel sama) dengan seri pengenceran tersebut.
4. Menyiapkan
medium NA cair (±50° C) dan menuangkan ke dalam ke tujuh cawan petri yang telah
berisi suspensi biakan yeast dari serangkaian seri pengenceran (1 : 100,
1 : 101, 1 : 102, ..., 1 : 106). Kemudian
memutar masing-masing cawan petri diatas meja dengan perlahan-lahan sebanyak
20x dengan gerakan membentuk angka 8.
5.
Membiarkan
agar dalam cawan petri menjadi padat. Setelah itu meletakkan cawan petri dalam
posisi terbalik dan menginkubasinya pada suhu kamar (±37° C) selama 24 jam.
6.
Mengamati
pertumbuhan dengan menghitung populasi koloni yang muncul dengan bantuan
coulter counter. Memilih cawan yang jumlah koloninya antara 30-300. Bila jumlah
koloni dalam satu cawan kurang atau lebih dari 30-300, maka tidak memenuhi
syarat untuk dihitung. Kalkulasi jumlah organisme atau yeast dalam sampel
adalah jumlah koloni yang memenuhi syarat, lalu menghitung rata-ratanya dan
jumlah koloni yang terhitung perpengencerannya hanya menggunakan dua bilangan
nyata. Satuan yang menggunakan adalah jumlah organisme per ml biakan atau
sampel (cfu/ml).
7.
Hasil
akhir dari praktikum diperoleh suatu grafik antara nilai absorbansi (OD)
masing-masing nilai pengenceran (sumbu y) dengan jumlah koloni masing-masing
pengenceran (sumbu x), sehingga diketahui korelasi antara nilai OD (kekeruhan)
dengan jumlah sel viable dalam biakan
E.
Hasil
pengamatan
Grup
|
OD
A610nm
|
Jumlah
sel/ml
|
cfu/ml
Tingkat Pengenceran
|
|||||||
10-2
|
10-3
|
10-4
|
10-5
|
10-6
|
10-7
|
10-8
|
10-9
|
|||
1
|
0,015
|
2,88.104
|
288
|
92
|
23
|
15
|
-
|
-
|
-
|
-
|
2
|
0,02
|
8,4.
105
|
-
|
-
|
84
|
23
|
1
|
12
|
-
|
-
|
3
|
0,04
|
1,10. 107
|
-
|
-
|
-
|
110
|
17
|
3
|
4
|
-
|
4
|
0,051
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
8
|
632
|
628
|
13
|
Dari tabel pengamatan di atas didapat beberapa
nilai yang memenuhi persyaratan statistik pada masing- masing OD, data yang
memenuhi sebagai berikut :
OD
|
CFU/ml
|
O,015
|
2,88
x 104
|
0.02
|
8,4
x 105
|
0,04
|
1,10
x 107
|
Korelasi yang
didapatkan yaitu 0,6603.
F.
Pembahasan
Pada praktikum kali ini kami mempelajari
tentang penghitungan kuantitas mikroba. Mikroba yang digunakan dalam praktikum
adalah Saccharomyces cereviceae. Metode yang digunakan untuk
penghitungan mikroba ini adalah metode hitungan cawan (TPC). Dalam metode ini ada beberapa hal
yang harus diperhatikan yaitu mengencerkan sampel dan mencawankan hasil pengenceran tersebut.
Sebelumnya
telah disediakan biakan dengan volume 9 ml. Dari biakan tersebut dihitung terlebih dahulu berapa kandungan OD
nya. Setelah diketahui kandungan OD dilakukan pengenceran pada biakan
tersebut. Pengenceran dilakukan beberapa
kali, yaitu 10-2, 10-3, 10-4, dan 10-5.
Hasil pengenceran tersebut dibiakkan dalam cawan. Kemudian didiamkan selama
tiga hari untuk dapat dilakukan penghitungan. Penghitungan mikroba dengan
metode cawan menggunakan alat spektrofotometer.
Dari hasil pengamatan dapat diketahui
bahwa semakin tinggi kandungan OD semakin banyak kandungan selnya begitu pula
sebaliknya. Semakin tinggi pengenceran semakin jarang bakterinya.
Nilai koefisien determinan
(R2) dari korelasi rata-rata jumlah koloni adalah
sebesar 0,6603. Nilai koefisien determinan yang tepat adalah 1. Dari nilai yang
kami dapatkan masih terlalu jauh dari 1. Hal ini dapat disebabkan karena kurang
telitinya dalam praktikum.
G.
Kesimpulan
1. Jumlah
mikroba yang memenuhi syarat yaitu:
Pada OD 0,015 jumlahnya
2,88 x 104
Pada OD 0,02 jumlahnya
8,4 x 105
Pada OD 0,04 jumlahnya
1,10 x 107
2. Semakin
besar jumlah pengenceran maka jumlah sel mikroba semakin sedikit, sedangkan semakin besar
OD jumlah sel bakteri semakin banyak.
3. Nilai koefisien determinan (R2) dari korelasi
rata-rata jumlah koloni dengan kekeruhan adalah sebesar 0,6603.
H.
Daftar
Pustaka
Hadioetomo, Ratna Siri. 1993. Mikrobiologi
Dasar dalam Praktek Jakarta: PT
Gramedia Pustaka Utama
Pelezar, Michael J. Dan E.C.S Chan. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta:
Penerbit Universitas Indonesia
Suriawiria, Drs.Unus.1998. Pengantar
Mikrobiologi Umum. Bandung :
Angkasa
